2023上海医疗器械创新展速递结合静电纺丝、纺织工艺以及热致相分离技术，构建骨-韧带-骨一体化支架用于前交叉韧带重建
2023-11-03
前交叉韧带重建术后经常避免膝关节主动完全伸展的原因。许多ACL的术后康复方案中要求限制膝关节避免从屈曲40°到完全伸展这一范围的主动活动。近期，东华大学莫秀梅教授、吴晶磊副教授和上海交通大学医学院附属第六人民医院赵金忠主任、蒋佳副主任在科爱创办的期刊Bioactive Materials上联合发表综述文章：骨-韧带-骨一体化支架用于前交叉韧带重建。该文章以前交叉韧带（ACL）损伤的修复为目标，通过对韧带移植物的结构进行整体性设计，将韧带段支架和骨隧道段支架整合，构筑一种骨-韧带-骨（BLB）一体化支架，并成功用于ACL重建。该文章创新性的给出三相结构组织工程韧带支架的制备方法，为新型一体化韧带支架的构建以及ACL重建提供新思路。
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研究内容简介
随着我国《全民健身计划》的持续实施，在不断发展群众体育、倡导全民健身新时尚、推进健康中国建设的同时，运动损伤的发生率也在逐年升高。ACL断裂是一种常见的膝关节运动损伤，主要是由于剧烈冲击或在低强度力下频繁拉伸造成，极大地影响了人们的健康与生活。由于ACL低血管性和低细胞性，并且对药物治疗反应较差，导致自我修复能力极差。临床上对于严重的ACL断裂，通常采用自体、异体或人工韧带进行手术重建。但现有的韧带移植物存在各自固有的缺点，如供体来源有限，免疫排斥或异物反应，缺乏骨传导性等。ACL重建仍然是目前临床治疗面临的巨大难题之一。因此，探索有效的ACL移植物对提高患者术后的生活质量以及减轻家庭和社会负担具有迫切的需求。该文章以ACL损伤的修复为目标，通过对韧带移植物的结构进行整体性设计，将韧带段支架和骨隧道段支架整合，构筑一种骨-韧带-骨一体化支架，并成功用于ACL重建（Fig.1）。
Fig. 1 Schematic illustration of the multiphasic BLB integrated scaffold enhances ligamentization and graft-bone integration after ACL Reconstruction.
BLB一体化支架设计为三相结构，中间部分为负载结缔组织生长因子（CTGF）的取向纳米纤维纱线编织支架，通过拓扑结构的接触诱导和生物信号的趋化作用促进BMSCs快速生长和成韧带分化。两端部分设计为负载介孔羟基磷灰石（MHA）和去铁胺（DFO）的多孔网络TIPS支架，诱导BMSCs向成骨细胞表型转换，并调节人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的VEGF表达，促进血管化骨再生，防止骨隧道扩大。MHA 形成的机理如图Fig. 2A所示，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）作为模版剂。Fig. 2B 展示骨-韧带-骨一体化支架的制备过程，静电纺丝技术制备芯层为丝素蛋白（SF）线， 皮层为 CTGF@PLCL 纳米纤维的纱线，最后通过编织方式将纳米纤维纱线组装成支架，作为一体化支架的中间段韧带部分。为了制备能够与编织支架紧密结合的骨隧道段支架，我们使用热致相分离的方法，PLA溶于高沸点、低挥发性的二氧六环溶剂中，形成均相溶液。然后降温冷却，在冷却过程中体系会发生热致相分离，形成以PLA为连续相，溶剂为分散相的两相结构。最后采用冷冻干燥的方法去除溶剂，得到孔径不一的三维多孔支架。通过此种方法，可以得到力学良好的一体化支架，并且热致相分离支架与编织支架牢固结合、不易脱落。
Fig. 2 Schemata of design and preparation of the multiphasic bone-ligament-bone integrated scaffold. (A) Diagram of the formation mechanism of the MHA powders using CTAB micelle porogen. (B) Scheme of BLB preparation by electrospinning technique and thermally induced phase separation (TIPS): Nanofiber yarn preparation by an emulsion electrospinning method (Step 1). NYs assembled into a braided scaffold (Step 2). Synthesis of MHA powders (Step 3). The DFO drug loaded by MHA (Step 4). DFO@MHA powders deposited on the PLA solution (Step 5). TIPS technique was used to fabricate the BLB scaffold by encapsulating the ends of the braided scaffold within the TIPS solution (Step 6).
通过TEM观察乳液纺纳米纤维（Fig. 3A），皮层和芯层的物质密度差异使纤维在高倍电子束下显示出深浅不一的颜色，呈现出“皮芯”双层结构。MHA呈均匀的棒状，长度约100 nm、宽度约30 nm，棒状结构内浅色阴影条纹代表形成的纳米孔道的边界，这是煅烧过程中除去CTAB模板剂所产生的空腔（Fig. 3B-C）。骨-韧带-骨一体化支架为三相结构包括位于中间部的编织段及位于两端的热致相分离段。支架两端的热致相分离结构致密，中间柔软的纳米纤维编织支架与韧带胶原纤维相对应。PLA支架中没有出现Ca和P元素，而PLA/MHA和PLA/DFO@MHA支架中Ca、P元素均匀分布。此外，在PLA/DFO@MHA支架中检测到N元素，证明DFO存在于支架中（Fig. 3G-H）。
Fig. 3 Microstructure and morphology characterization of nanofibers, MHA, DFO@MHA, and BLB scaffolds. TEM micrographs of (A) nanofibers, (B) MHA, and (C) DFO@MHA. (D) FTIR spectra of HA, MHA, and MHA-CTAB. (E) XRD patterns of HA and MHA. (F) The nitrogen adsorption/desorption isotherms and pore size distribution graph (insert) of the MHA powders. (G) The macroscopic view of three kinds of BLB scaffolds. (I) SEM images of the cross-section of BLB scaffolds. (J and K) SEM images of SF, SF/PLCL, and SF/CTGF@PLCL nanofibers and their braided scaffolds. (H) The SEM images and EDS elemental mappings of PLA, PLA/MHA, and PLA/DFO@MHA samples.
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细胞增殖活性结果显示，与纯PLA支架相比，MHA修饰的支架促进BMSCs的黏附和增殖，此外适量 DFO 的加入对细胞生长没有明显的影响。细胞沿着SF/PLCL和SF/CTGF@PLCL支架中纤维方向生长，这是因为纱线皮层的取向纤维结构可以诱导细胞取向生长、增殖。拓扑结构信号（纳米级纤维）和生物功能信号（CTGF）对 BMSCs 的增殖有共同促进作用。碱性磷酸酶和茜素红染色结果表明，MHA和DFO发挥协同诱导BMSCs 成骨分化的作用。采用RT-qPCR测定成骨细胞标志基因和肌腱相关基因的表达。结果表明，同时负载 MHA 和 DFO 的 PLA/DFO@MHA 可以明显增强 BMSCs 的成骨分化，并且比单独载有MHA纳米粒子组的效果更好。CTGF的存在提高了肌腱标记物的表达，诱导BMSCs成肌腱细胞分化（Fig. 4）。
Fig. 4 Cytocompatibility and cell differentiation of BMSCs on scaffolds. (A) Calcein AM (green, live cells) and PI (red, dead cells) staining, (B) Phalloidin (F-actin) and DAPI (nuclei) staining for BMSCs on PLA, PLA/MHA, and PLA/DFO@MHA scaffolds at day 7. (C) Calcein AM (green, live cells) and PI (red, dead cells) staining, (D) Phalloidin (F-actin) and DAPI (nuclei) staining for BMSCs on SF, SF/PLCL, and SF/CTGF@PLCL scaffolds at day 7. (E and F) The cell proliferation of BMSCs cultured on different scaffolds was measured using CCK-8 method. (G) Representative ALP staining images of BMSCs on PLA, PLA/MHA, and PLA/DFO@MHA scaffolds for 7 days, and (H) quantitative analysis of ALP activity for 7 and 14 days. (I) ARS staining and (J) quantitative analysis of BMSCs on PLA, PLA/MHA, and PLA/DFO@MHA scaffolds after osteogenic induction for 14 days. (K-M) The expression of osteogenic differentiation-related genes including COL Ⅰ, Runx2, and OPN of BMSCs cultured on PLA, PLA/MHA, and PLA/DFO@MHA scaffolds at day 14. (N-P) The expression of ligament differentiation-related genes including COL Ⅰ, TNC, and SCX of BMSCs cultured on SF, SF/PLCL, and SF/CTGF@PLCL scaffolds at day 14. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test, *p < 0.05, **p < 0.01.
骨-韧带-骨一体化支架用于新西兰白兔前交叉韧带重建手术，PHD-SPC组再生韧带显示出有光泽的白色外观，表面与正常韧带一样光滑，支架与骨界面被新生骨包绕，与骨结合牢固、融为一体。并且与P-S组和PH-SP组新生组织相比，PHD-SPC组再生和重塑过程更好。组织学评价结果显示，SF/CTGF@PLCL组有大量的弹性纤维， 在三组中表现出最好的组织浸润，具有高度卷曲的胶原纤维束特征，显示出类似于天然韧带的结构，CTGF促进了再生韧带组织的不断成熟（Fig. 5）。
Fig. 5 Histopathological and biomechanical analysis of the new formed tissue within the implanted BLB scaffolds. (A) Schematic diagram of BLB scaffolds used for ACL reconstruction surgery in rabbit models. (B) The macroscopic view of regenerated ACL in different groups at 1, 3, and 6 months postoperatively. (C) Picrosirius red, (D) HE, (E) COL Ⅰ, and (F) COL Ⅲ staining of the regenerated ligament in three groups at 1, 3, and 6 months postoperatively, the arrow indicates the implanted grafts. (G and H) The biomechanical analysis of regenerated ACL in each group at 1, 3, and 6 months postoperatively. The detection items are (G) ultimate failure load and (H) stiffness. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test, *p < 0.05, **p < 0.01.
2023上海医疗器械创新展Medtec创新展发现，通过组织学染色评价隧道内新生骨组织的形成情况，术后6个月，可以观察到PLA组移植物-骨界面仍有大量瘢痕组织，PLA/MHA组新生骨组织与移植物接壤，而 PLA/DFO@MHA组移植物内部观察到大量新骨组织长入，并且可以看到更加完整的新生骨。
PLA组缺损部位的胶原和再生骨组织非常有限，仅观察到少量新骨，PLA/MHA 组比PLA组有更多的骨组织形成。PLA/DFO@MHA组显示更多形貌完整的新生骨组织，新生骨组织和胶原量最多，同时在新生骨中大量胶原被染成红色，说明有部分骨组织已经较成熟。结果表明，含有MHA特别是DFO的支架加速了体内新骨形成。早期血管化评价表明，局部 DFO 释放可以实现支架内的三维血管再生， 增强成骨和血管生成活性。Micro-CT 分析结果显示，PLA/DFO@MHA 组在缺损区域显示最密集的骨小梁， 新形成的骨密度更大，表明 PLA/DFO@MHA 支架具有良好的骨传导性，促进骨修复（Fig. 6）。
Fig. 6 Histopathological and Micro-CT imaging analysis of bone tunnels indifferent groups after surgery. Representative images of (A) HE, and (B) Massonstaining of the decalcificated bones slice afterimplantation of various scaffolds for 1, 3, and 6 months. (C) Representativeimmunofluorescence histochemical images ofHIF-1α and α-SMA staining of the decalcificated bones sliceafter implantation of various scaffolds for 1 month. (D and E) Quantitative analysis of the positively stained areas usingImage-Pro Plus software based on the immunofluorescence histochemical images ofHIF-1α and α-SMA. (F) Micro-CT images of the cross-sections of thefemoral bone tunnels and (G) three-dimensional reconstructed micro-CT imagesshowing the effect of different scaffolds on the new bonetissue formation inside the defect site. The bone defect area was circledby a dotted line (red). (H and I) The average bone tunnel area, and BV/TVvalues were calculated using the CT-Analyzer software after 1, 3, and 6 months.Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Tukey’smultiple comparison test, *p < 0.05, **p < 0.01.
02
论文第一/通讯作者简介
共同第一作者：谢宪瑞、蔡江瑜
谢宪瑞：东华大学博士毕业生，滨州医学院青年教师。从事静电纺纳米纤维在生物医学中的应用、组织工程支架的构建及应用等工作。
蔡江瑜：上海市第六人民院住院医师，从事再生运动医学与转化工作。
共同通讯作者：莫秀梅、吴晶磊、赵金忠、蒋佳
莫秀梅：东华大学二级教授，博导，上海纳米生物材料与再生医学工程中心主任。曾为京都大学博士后、新加坡国立大学研究院、亚琛工业技术大学访问教授。从事静电纺纳米纤维用于组织再生的研究达二十多年之久，在纳米纤维用于血管再生、皮肤再生、神经再生、肌腱再生、骨和软骨再生中做出了许多成果，还从事医用水凝胶和3D打印组织工程支架研究，主持和承担国家“十三五”重点研发项目、国家高技术研究发展863计划、国家自然科学基金、上海市科委重大重点等基金、企业技术开发项目等100多项，申请有关专利118项，授权专利40项，主编和参编专著15部，发表SCI文章453篇，总引用量1.2万次，h-index为55，莫秀梅在静电纺丝领域的研究论文发表世界排名第七。研究成果分别荣获2008年上海市技术发明一等奖，2009年国家科技进步二等奖,2015年上海市自然科学三等奖。入选2019，2020,2021年中国高被引学者、荣获姑苏创业领军人才（2020）、第六届“中国侨界贡献（创新人才）奖”（2016）、烟台“蓝海英才计划”高端创新人才（2015）奖励计划、为上海市教育系统三八红旗手（2014）、上海市巾帼建功标兵（2013）。现担任8个学会的副主任委员及理事，包括中国复合材料学会超细纤维分会副主任委员，中国生物材料学会理事，中国生物医学工程协会生物材料分会理事。作为大会主席召开了2015年第二届国际血管组织工程大会、2019年第六届国际静电纺大会、2020年海峡两岸暨港澳生物材料及组织再生青年科学大会， 2021年中德澳三边国际会议。
课题组主页：http://www.xiumeimo.com
吴晶磊：工学博士，副研究员，硕士生导师。2017年8月毕业于德克萨斯大学生物医学工程专业。主持国家自然科学基金青年项目1项、上海市科学技术委员会“科技创新行动计划”“一带一路”国际合作项目1项、参与国家重点研发项目1项（子课题负责人）；发表论文60余篇，授权发明专利10余项。研究方向：1. 脱细胞基质材料在组织修复与再生的应用。2.免疫与炎症调节生物材料。3.可注射型生物医用水凝胶。
赵金忠：教授，主任医师，博士研究生导师，现任上海市第六人民院运动医学科主任，国家骨科医学中心副主任，国家重点研发计划项目首席科学家，中国研究型医院学会运动医学专业委员会主任委员，国家药监局医疗器械技术审评专家咨询委员会委员，上海交通大学运动转化医学中心PI，上海交通大学系统生物学院特聘研究员，上海交通大学医疗机器人研究院兼职教授，东华大学纺织学院硕士研究生校外指导导师，上海市第六人民医院运动医学生物力学实验室负责人。
蒋佳：上海市第六人民医院运动医学科副主任医师，硕士研究生导师，从事再生运动医学与转化工作。担任亚洲-太平洋地区骨科运动医学学会会员，亚洲膝关节镜运动医学学会会员，纳米生物医药专业委员会委员，《中国骨与关节杂志》编委，《中国组织工程研究与临床康复》审稿专家。
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资助信息
该研究获 国家自然科学基金(82102579, 81871753)、中央高校基本科研业务费专项资金(2232019A3-07，2232019D3-20) 、国家重点研究发展计划（2018YFC1106200, 2018YFC1106202）、上海市科学技术委员会(20S31900900，20DZ2254900) 、中德科学基金研究交流中心（M−0263）和上海市启明星人才计划（22QC1401200）等基金的支持。
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原文信息
Xianrui Xie1, Jiangyu Cai1, Dan Li, Yujie Chen, Chunhua Wang, Guige Hou, Thorsten Steinberg, Bernd Rolauffs, Mohamed EL-Newehy, Hany EL-Hamshary, Jia Jiang****, Xiumei Mo*, Jinzhong Zhao**, Jinglei Wu***. Multiphasic bone-ligament-bone integrated scaffold enhances ligamentization and graft-bone integration after anterior cruciate ligament reconstruction.
Bioactive Materials, 31 (2024) 178–191.
DOI: 10.1016/j.bioactmat.2023.08.004
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