预血管化在开发植入式工程3D组织方面受到了极大的关注。虽然已经开发了各种预血管化技术来改善移植物血管化，但尚未研究预血管化模式对体内新血管形成的影响。近日，来自韩国蔚山科学技术学院（UNIST）的Hyun-Wook Kang团队开发了一种功能性预血管化结构，可显着促进移植物血管化，并对各种印刷设计中的微血管模式(µVP)进行了体内评估（图1）。该预血管打印技术将为植入式工程组织/器官的升级提供新的可能性。高端医疗设备展Medtec China 2023近日了解到相关论文“Bioprinting of pre-vascularized constructs for enhanced in vivo neo-vascularization”于2023年4月3日在线发表于杂志《Biofabrication》上。

1. 诱导高密度成熟毛细管网络产生设计的微血管图案（µVP）

首先，研究者通过共同打印内皮细胞（EC）和脂肪来源的干细胞（ADSC）来诱导高密度成熟毛细管网络产生设计的微血管图案（µVP）。以EGM-2为共培养基，打印包含EC/ADSC生物墨水排列图案的构建体，并在培养过程中观察到毛细管的形成（图2a）。使用含有不同浓度ADSC和固定浓度EC的生物墨水比较毛细管的形成（图2b-d）。最后，确定了用于打印µVP以进行后续实验的最佳EC/ADSC浓度比为5:10。为了确认微血管模式中形成的毛细血管是否具有体内成熟特征，在培养过程中对打印的µVP进行了免疫染色，结果表明：EC可以在ADSC支持下形成成熟的毛细管网络，作为印刷图案中的血管周围细胞（图2e-f）。随后，研究者打印了具有无细胞图案（AP）和µVP的构建体，并用小鼠股动脉血管束模型进行了体内实验（图2g）。结果表明，与AP相比，放置在AV束旁边的µVP显著增加了植入物的新生血管形成（图2h-i）。

2. 预血管化构建体对移植物血管化的模式效应研究

为了研究是否可以通过考虑宿主血管（AV束）的位置控制µVP的设计来诱导加速移植物血管形成，研究者将具有三种不同设计（µVP近端、µVP远端和µVP组合）的预血管化构建体打印并植入AV束模型（图3a）。µVP内的EC在第2天显示出活性发芽形态，并且在植入前（第7天）观察到每组中形成高密度毛细管网络（图3b）。当观察收获的构建体时，获得了2周植入的不同新生血管结果（图3c）。µVP近端和远端组的几个构建体显示出从AV束延伸的粗支血管，而一些µVP组合组的样本主要覆盖着成熟的血管和毛细血管，结果表明µVP组形成了直径相似的分支血管（图3d-g）。

此外，研究者为了验证体积定量结果，分析了免疫组织化学作为新血管化定量的传统方法。用小鼠特异性抗CD31和抗α-SMA进行免疫组织化学染色，以观察构建体内浸润的宿主血管（图4a）。所有量化结果（染色血管的密度和直径）均显示出µVP近端组、远端组和组合组的增加趋势（图4b-d）。证实µVP远端组比µVP近端组显示出更高的新生血管化，具有这两种模式的µVP联合组可以促进显著的移植物血管化。

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3. µVP和AMP对移植物血管形成的协同作用

随后，研究者确定AMP是A20的理想条件，并设计了我们新的预血管化构建体（图5a）。将µVP置于宿主血管附近，以集中血管整合能力，而将AMP置于远离宿主血管的位置，以形成血管生成因子梯度。利用这两种模式的协同作用，与之前的结果相比，有望实现强大的移植物血管化。研究了三种不同设计（仅µVP、仅AMP、µVP+AMP）的印刷构建体的体内新生血管化结果（图5b），所有三组在植入2周后都诱导了高血管化结果，但仅AMP组显示出整体较短的新生血管形态（图5c）。比较各组的新生血管化评分，µVP+AMP组的样本更频繁地显示出高分（图5d）。

最后，研究者对两组患者进行了免疫组织学分析。µVP+AMP组的mCD31阳性和α-SMA阳性血管明显多于仅µVP组和仅AMP组（图6a）。定量结果还表明，两组之间的血管密度和统计学意义存在差异（图6b-c）。此外，µVP+AMP组的α-SMA阳性血管直径（44.75 ± 9.64 µm）约为仅µVP组和仅AMP组的1.7倍（图6d）。最后，用抗hCD31抗体对收获的构建体进行免疫染色，以观察移植后植入的毛细管网络（由人EC组成）（图6e）。这些结果清楚地表明，植入具有µVP和AMP的预血管化构建体可以引导强大的移植物血管化，并具有两种印刷模式的协同作用。

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图6 植入结构的免疫组织化学分析

综上，本文开发了预血管化的构建体设计，包括能够促进移植物血管化的协同印刷图案（µVP和AMP）。建立了印刷条件，以诱导印刷的µVP内形成高密度成熟毛细管，并证实了µVP对AV束模型植入体内新生血管形成的模式效应。最后，设计了使用µVP和AMP的预血管化构建体来改善旁分泌功能，并通过植入实验证实了协同双重模式促进移植物血管化的有效性。此方法被认为是一种有效的预血管化策略，用于实现大规模人工组织的快速血管化，并开发用于缺血性疾病的功能性植入物。

文章来源： EngineeringForLife